CDKN1A/p21 Role in the Survival and Expansion of Breast Cancer Stem Cells following Oxidative Damage

Abstract

Aquesta tesi investiga el paper de CDKN1A/p21 en la supervivència de les cèl·lules mare del càncer de mama (BCSCs) després del dany a l’ADN. Les BCSCs constitueixen una petita subpoblació tumoral amb capacitat d’autorenovació, inici tumoral i resistència intrínseca a la teràpia convencional. Tot i que la majoria de cèl·lules tumorals poden ser eliminades per la quimioteràpia, les BCSCs poden romandre en estat latent i contribuir posteriorment a la recaiguda i la metàstasi. A més del seu paper clàssic en l’aturada del cicle cel·lular, CDKN1A/p21 també regula processos transcripcionals vinculats a l’apoptosi, la senescència i la supervivència cel·lular. La hipòtesi principal de la tesi és que CDKN1A/p21 promou la supervivència de les BCSCs mitjançant la regulació directa de programes transcripcionals associats a la resistència terapèutica. Per estudiar-ho, es van utilitzar models tridimensionals d’oncosferes enriquits en cèl·lules mare canceroses. La depleció de CDKN1A/p21 va reduir la iniciació i el creixement dels esferoides tant en condicions basals com després d’estrès oxidatiu, indicant que aquesta proteïna és essencial per al manteniment i la supervivència de les BCSCs. També es van avaluar moduladors farmacològics de CDKN1A/p21. UC2288 no va reduir els nivells nuclears de la proteïna, mentre que TSA en va augmentar l’expressió. Ambdós tractaments van induir apoptosi i reduir el creixement dels esferoides, tot i mostrar efectes inesperats sobre la seva formació. A nivell unicel·lular, la microscòpia de cèl·lules vives va revelar una expressió heterogènia de CDKN1A/p21 després del dany oxidatiu, associada a diferents destins cel·lulars. Finalment, estudis de transcriptòmica espacial i ChIP van demostrar que CDKN1A/p21 regula gens vinculats a metàstasi i característiques stem-like, suggerint que actua com a regulador transcripcional mitjançant interacció directa amb la cromatina

This thesis investigates the role of CDKN1A/p21, a cyclin-dependent kinase inhibitor, in the survival of breast cancer stem cells (BCSCs) following DNA damage. BCSCs are a small tumour subpopulation characterized by self-renewal, tumour-initiating capacity, and intrinsic resistance to conventional therapies. Unlike the bulk of tumour cells, which are often eliminated after chemotherapy, BCSCs can survive in a dormant state and later drive tumour relapse and metastasis. Although CDKN1A/p21 is classically known for inducing cell-cycle arrest after DNA damage, emerging evidence suggests additional functions in transcriptional regulation and cell-fate determination. Within the nucleus, CDKN1A/p21 can interact directly with chromatin, influencing apoptosis, senescence, proliferation, and adaptation to genotoxic stress. This thesis hypothesizes that CDKN1A/p21 promotes BCSC survival after DNA damage by regulating transcriptional programs linked to therapy resistance. To investigate this, 3D spheroid cultures enriched for cancer stem cells were used as a model system. Manipulation of CDKN1A/p21 expression revealed that its depletion significantly impaired spheroid initiation and growth under basal conditions and reduced cell viability and spheroid regeneration following oxidative stress. These findings demonstrate that CDKN1A/p21 is essential for both maintenance and post-treatment survival of BCSCs. Pharmacological modulation of CDKN1A/p21 using UC2288 and TSA showed that current compounds do not reliably control its activity, despite inducing apoptosis and reducing spheroid growth. Live-cell imaging further revealed heterogeneous CDKN1A/p21 expression dynamics after oxidative damage, associated with distinct cellular fates. Cells with high CDKN1A/p21 expression formed larger but less proliferative spheroids, consistent with a quiescent stem-like phenotype. Spatial transcriptomic analysis identified a CDKN1A/p21-high cell cluster co-expressing metastasis-associated genes including SPP1, TMSB10, and TMSB4X. Chromatin immunoprecipitation demonstrated direct binding of CDKN1A/p21 to the promoters of these genes and CD44. Overall, the findings support a novel role for CDKN1A/p21 as a chromatin-associated transcriptional regulator that promotes BCSC survival, resistance, and metastasis.

Ciències de la Salut (RD 99/2011)